روش پژوهش ژنتیک مولکولی

به کاوش و شناسایی انواع روش ساختار DNA مورد استفاده قرار مولکولی ژنتیکی است. برای هر منطقه DNA، که به بررسی این منطقه از کروموزوم، ژن و یا آلل، روش متفاوت است. مبنای هر روش ژنتیک مولکولی شامل برخی یا دستکاری دیگر از RNA و DNA. همه این روش ها توسط یک پیچیدگی عظیم مشخص، بدون شرایط آزمایشگاهی می توانید انجام نبود، و کارکنان باید بسیار مهم است. این کار در چند مرحله انجام شده است.

مراحل

ابتدا نمونه RNA یا DNA به تولید می شود. در اینجا، یک روش ژنتیک مولکولی می توان به تقریبا هر ماده اعمال می شود: یک قطره از خون، لوکوسیت، فیبروبلاست فرهنگ، مخاط (خراشیده)، حتی فولیکول های مو، - DNA را می توان از هر نمونه به دست آمده. این مناسب است برای استفاده از هر روش ژنتیک مولکولی و گزینه های مختلف است و DNA طولانی جدا شده منجمد ذخیره شده است. مرحله دوم به تجمع قطعات مورد نظر (تقویت) از DNA اختصاص داده شده، به عنوان آن کمک می کند تا اطمینان حاصل شود که واکنش زنجیره ای پلیمراز در شرایط in vitro (در شرایط آزمایشگاهی بدون دخالت زندگی ارگانیسم). در نتیجه، انتخاب قطعه DNA تکثیر شده توسط این واکنش زنجیره ای، و مقدار به معنای واقعی کلمه میلیون ها بار DNA افزایش می یابد.

گام سوم در روش های پژوهش ژنتیک مولکولی فرض بر این است محدودیت ضرب DNA (این تکه تکه شدن، پاره شدن و یا برش). محدودیت در پلی آکریل آمید و یا ژل آگارز الکتروفورز انجام شده توسط. این روش مولکولی ژنتیکی مطالعه قطعه DNA اجازه می دهد تا همه را به یک موقعیت خاص در ژل. پس از آن، این ژل با اتیدیوم بروماید درمان، قادر به اتصال به DNA، تابش با نور ماوراء بنفش، سپس آن را ممکن است برای مشاهده بخش های لومینسانس. روش های تشخیصی ژنتیک مولکولی متنوع و متعدد هستند، اما دو مرحله اول مشترک به تمام هستند. اما به منظور شناسایی قطعات DNA، ژل را می توان رنگی، و بسیاری دیگر از روش های موجود.

گونه

روش مستقیم ترین و گسترده برای تشخیص مایکوباکتریوم ممکن است شامل روش یادگیری DNA ژنتیک مولکولی بالا. اصل آن است که، به منظور شناسایی مواد زنجیره ای اسکن از قطعات خاص از DNA عوامل بیماری زا. تکنیک های تشخیصی ژنتیک مولکولی هنوز یک راه کارآمد تر به رسمیت شناختن چنین بیماری سل ندارد. با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، شما می توانید مطمئن باشید که DNA اصلی خواهد شد تعدادی از نسخه در یک میلیون بار افزایش می دهد، که شده است، وجود خواهد داشت تقویت، و آن را به نتایج نشان می دهد. بیش از نود و پنج درصد است، که مزیت اصلی این روش - سطح حساسیت بسیار بالا است.

بقیه از روش های مولکولی ژنتیکی از تحقیقات بر روی اثربخشی عملکرد نسخه های متعدد به معنای واقعی کلمه از دو برابر، چون در این مورد نمونه تهیه پیش نویس را نشان می دهد یک دنباله الیگونوکلئوتیدی خاص به یک صد و شش بار افزایش یافته است. حتی تشخیص فرهنگ سل از سیستم تنفسی به طور قابل توجهی حساسیت آن را کاهش دهد. به همین دلیل است طب مدرن در روش های ژنتیکی مولکولی تشخیص سل است. روش توصیف موثر است به ویژه هنگامی که با پاتوژن تنوع آنتی ژنی بالا، مشخص است که راه دیگری است بسیار مشکل تر - نیاز به ویژه رسانه های مواد مغذی و پرورش به مدت طولانی. روش های ژنتیکی بیوشیمیایی و مولکولی تولید اثر بسیار متفاوت در نتایج.

تشخیص سل

تشخیص مارشال PCR سل شایع ترین استفاده از آن توالی های DNA که خاص برای همه چهار نوع از این بیماری هستند. برای رسیدن به این هدف اغلب استفاده آغازگر که تشخیص توالی عناصر (IS-986، IS-6110)، که این عناصر را مشخص گونه بسیار مهاجر سل و همیشه نسخه های متعدد در حال حاضر در ژنوم است. همچنین استخراج DNA را می توان از کشت خالص و بالینی (خلط از بیماران) توسط هر روش مناسب دیگر انجام شده است. به عنوان مثال، روش بوم وجود دارد که در آن بافر لیز کننده است بر اساس تیوسیانات گوانیدین و سیلیکا به عنوان DNA حامل استفاده می شود. تعداد بیماران که متفاوت باکتریولوژیک فقیر افزایش است هر سال، و در نتیجه در عمل بالینی یک سطح کاملا متفاوت از سازمان ایجاد کرده است: روش مولکولی ژنتیکی مطالعه DNA شده است بازی یک نقش عمده ای در تشخیص.

با این حال، باید اعتراف کنیم که آن را بدون اشکالات نیست. روش PCR است که استفاده از اغلب به ارمغان می آورد تعداد زیادی از نتایج مثبت کاذب، و دلیل نه تنها خطاهای فنی، بلکه از ویژگی های این روش است. علاوه بر این، با استفاده از این روش تشخیص برای تعیین درصد زنده از مایکو باکتریا، که شناسایی شده اند، آن است که به سادگی غیر ممکن است. اما این نقطه ضعف است که مهم ترین است. روش ژنتیک مولکولی تشخیص PCR مستلزم خطر آلودگی از DNA مایکوباکتریوم. مورد نیاز صدور گواهینامه به این دلیل که برای آزمایشگاه PCR منحصرا سخت، آنها نیاز به سه محل جداگانه. تکنولوژی PCR مدرن و بسیار پیچیده است، آن نیاز به استفاده از تجهیزات مناسب و پرسنل بالا آموزش داده است.

bacterioscopy

هنگامی که نتایج تشخیص تجزیه و تحلیل باید با داده های دیگر مقایسه شود: معاینه بالینی، رادیوگرافی، میکروسکوپ لام، برش و حتی پاسخ به درمان خاصی بسیار مهم است. در این مجموعه، مطالعات PCR تنها یکی از اجزای. تشخیص پاتوژن در اوایل تشخیص می تواند ساده ترین و سریع ترین روش - باکتریولوژیک.

استفاده از میکروسکوپ نوری (رنگ آمیزی Ziehl-نیلسن) و فلورسنت (رنگ آمیزی فلوروکروم) وجود دارد. مزیت سرعت اسمیر نتایج است. اما نقطه ضعف آن به درستی به ظرفیت محدود با توجه به حساسیت کم است. اما، این روش توصیه WHO به عنوان مقرون به صرفه ترین و زمین برای تشخیص بیماران مبتلا به سل داده شده است. تشخیص روش باکتریولوژیک مایکوباکتریوم دارای ارزش پیش بینی و برآورد دفع کمی باکتریایی است. اعتماد به نفس بیشتری به مقابله با آن روش های مولکولی تحقیقات ژنتیکی سل.

فرهنگ

تشخیص بهتر از مایکوباکتریوم مطالعات فرهنگی را تشخیص دهد. کاشت مواد پاتولوژیک آن را به محیط تخم مرغ ساخته شده است: Mordovsky، فین دوم، LJ، و مانند آن. معیار مقاومت مایکوباکتریوم به داروها و شواهد غیر مستقیم از اثر بخشی تعدادی از مایکوباکتریوم و مستعمرات خود در شرایط آزمایشگاهی، اگر به روش اعمال فرهنگ پژوهش. برای افزایش درصد از انزوا از تلقیح مایکوباکتریوم از مواد پاتولوژیک است محیط های متعدد برگزار می شود.

رفع نیازهای متعدد فرهنگی، پاتوژن از جمله کمک هزینه و مایعات است. مورد استفاده در این سیستم و خودکار نوع اندازه گیری رشد VANTES. محصولات باید در جوجه کشی تا هفت تا هشت هفته برگزار می شود. در این زمان محصول با عدم رشد را می توان منفی است. تشخیص مواد آلوده خوکچه هندی، که به سل بسیار حساس هستند: موثر ترین راه برای تشخیص سل نمونه های بیولوژیکی در نظر بگیرید.

برخی از چهره های

عفونت نهفته - میدان جالب از مطالعه، که توسط تشخیص PCR افتتاح شد به مطالعه سل بود. مفهوم مدرن عفونت سل نشان می دهد که از یک صد افرادی که در تماس با سل بود، نود و ممکن است به خوبی آلوده شود، اما تنها ده نفر از آنها عبارتند از: بیماری فعال در حال توسعه است. برخی دیگر ایمنی سل، و چون نود درصد از موارد عفونت نهفته باقی مانده است. شناسایی یک الگوی آن به یک روش ژنتیک مولکولی کمک کرد.

متخصصان ژنتیک می گویند که پنجاه و پنج درصد از کسانی که محصولات پاتولوژیک مواد منفی بود و هشتاد درصد از افراد آلوده به سل، اما جریان با هیچ تظاهرات رادیوگرافیک بیماری، پاسخ مثبت PCR دریافت کرده است. این یک روش تشخیصی ژنتیکی کمک به شناسایی بیماران در معرض خطر توسط مطالعات PCR، با نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل آنها (میکروسکوپ و فرهنگ) است شد منفی، و عفونت تحت بالینی سل حاضر بود.

تحقیقات مدرن

فدراسیون روسیه و آزمایشگاه باکتریولوژیک استفاده از یک روش سریع غلظت مطلق: فعالیت نیترات ردوکتاز مایکوباکتریوم تست شده توسط معرف گریس. مراکز ضد سل استفاده از یک روش است که اجازه می دهد تا برای تعیین مقاومت دارویی. این بذر در رسانه های مایع، که در آن خودکار رادیومتری و سیستم حسابداری فلورسنت رشد مایکوباکتریوم. تا دو هفته تا - چنین تجزیه و تحلیل است که به سرعت انجام می شود.

در حال حاضر، روش های جدید در حال توسعه هستند: مقاومت در برابر مواد مخدر از مایکوباکتریوم است که در سطح ژنوتیپ اندازه گیری. بررسی مکانیزم های مولکولی ژن های مقاومت و حضور در مایکوباکتریوم نشان می دهد. این ژن با مقاومت به داروهای خاصی همراه است. به عنوان مثال، ژن KASA، inhA در، KatG از مقاوم به ایزونیازید، ژن rpoB - ژن های RNA 16Sp ریفامپین و rpsL - استرپتومایسین، emb1 - به اتامبوتول، gyrA - فلوروکینولون و غیره.

جهش

تشخیص مدرن برای مطالعه DNA به طور قابل توجهی افزایش یافته است از روش سطح مولکولی-ژنتیک و مجاز به انجام مطالعات در مقیاس بزرگ از جهش در تمام طیف خود دارند. در حال حاضر ما می دانیم که جهش متداول در 516، 526 و 531 کدون ژن rpoB، و مقاومت به داروهای شناخته شده است. است طیف وسیعی از روش های برای تایپ کردن از مایکوباکتریوم استفاده از نه تنها از روش های سنتی وجود دارد - بیوشیمیایی، بیولوژیکی و فرهنگی، بلکه به طور گسترده ای از تکنیک های ژنتیک مولکولی مدرن است. در حال حاضر کافی وجود دارد و ارائه روش تشخیص صحیح برای تشخیص بیماری های تک ژنی. آنها در مطالعات DNA در منطقه دقیق از یک ژن خاص است. این است که معمولا یک فرایند پیچیده، وقت گیر و گران است، اما داده ها است که توسط تجزیه و تحلیل ژنتیکی مولکولی فراهم است، بسیار دقیق تر و آموزنده تر از داده ها از تمام تجزیه و تحلیل است.

مدت طولانی است که شناخته شده است که DNA برای تمام عمر از ارگانیسم که آن را در هر odnakova سلول های هسته دار است تغییر دهید، و این امکان را به تجزیه و تحلیل کاملا تمام سلول های بدن، در هر مرحله از رشد شناسی. ژن آسیب دیده می تواند قبل از ظهور علائم برای اولین بار به بیماری بالینی در مقیاس کامل، و همچنین در افراد هتروزیگوت سالم تشخیص داده، اما داشتن یک جهش در ژن. روش های تشخیصی بیماری ارثی ژنتیک مولکولی اجازه می دهد به فاش آن (رویکرد مستقیم، DNA تشخیص)، و همچنین به تجزیه و تحلیل تفکیک این بیماری در خانواده با DNA نشانگر جایگاه (پلی مورفیسم ژنتیکی)، که از نزدیک با ژن آسیب دیده (یعنی رویکرد غیر مستقیم از DNA تشخیص) مرتبط است. مستقیم یا غیر مستقیم - هر تشخیص DNA روی روش های شناسایی بخش به شدت تعریف از DNA انسان است.

روش مستقیم

روش مستقیم تشخیص DNA هستند که بیماری ارثی ژن مقصر شناخته شده است، به خوبی شناخته شده، نوع جهش آن است. برای مثال، یک روش مستقیم مناسب در تعدادی از بیماری. این کره هانتینگتون (پسوند CTG-تکرار)، فنیل کتونوریا (R408W)، فیبروز سیستیک (delF508، جهش بزرگ) و مانند آن. مزیت اصلی روش مستقیم دقت تشخیصی به طور کامل متعلق است، و بدون نیاز به انجام تجزیه و تحلیل DNA از بقیه خانواده وجود دارد. اگر یک جهش در ژن مربوطه پیدا شود، آن اجازه می دهد تا دقیقا تایید تشخیص وراثت، تعیین ژنوتیپ برای بقیه خانواده بر دوش.

یکی دیگر از تشخیص مستقیم استفاده در نظر گرفته شده برای شناسایی یک حامل هتروزیگوت جهش بد را از اقوام و پدر و مادر که از این بیماری جان باختند. این امر به ویژه برای بیماری های اتوزوم مغلوب. معایب روش مستقیم نیز در دسترس هستند. برای اعمال آنها، شما باید بدانید که دقیقا ترجمه و بومی سازی ژن غیر طبیعی، ساختار اگزون اینترون از طیف آن و جهش آن است. همه بیماری های تک ژنی امروز چنین اطلاعاتی دریافت کرده اند. روش مستقیم ارزشمندی اطلاعات را نمی توان کامل، چرا که یک و همین ژن ممکن است تعداد زیادی از جهش پاتولوژیک است که باعث ابتلا به بیماری های ارثی داشته باشد.

روش های غیر مستقیم

روش غیر مستقیم در تشخیص DNA در همه، مورد استفاده در موارد دیگر، اگر ژن آسیب دیده است مشخص نیست، اما تنها کروموزومی، و یا اگر تشخیص خط بود نتیجه نمی دهد (آن اتفاق می افتد، اگر ژن سازمان مولکولی پیچیده و یا تا حد زیادی، اگر مقدار زیادی وجود دارد جهش پاتولوژیک). روش غیر مستقیم تجزیه و تحلیل تفکیک نشانگر در خانواده آللی انجام شده است. نشانگر موجود در منطقه کروموزومی و یا همان منبع است که از نزدیک به این بیماری ارتباط دارد و نشان دهنده حذف و یا اضافه، تعویض نقطه، تکرار، و چند شکلی آنها به دلیل مقدار مختلف از سلول های در بلوک.

راحت ترین برای تشخیص ریزماهواره در نظر گرفته و مینی ستلایت پلی مورفیسم غیر مستقیم، که به طور گسترده ای در ژنوم انسان توزیع شده است. ارزش آنها بیان شده در محتوای اطلاعات بالا، اگر آسیب به فاصله ژنتیکی بین نشانگر و ژن بیش از حد بزرگ است. در مورد دوم، دقت برآورد شده است تا حد زیادی تعیین فراوانی نوترکیبی بین نشانگر چند شکل و آسیب است. روش های تشخیصی غیر مستقیم نیز گام مقدماتی اجباری از فراوانی آلل مطالعه جمعیت مورد تجزیه و تحلیل در میان بیماران و حامل جهش، به علاوه ضرورت تعیین احتمال نوترکیبی از غیرتعادلی و چسبندگی نشانگرها و آلل جهش یافته فراهم می کند.

روش های دیگر

بخش کوتاه از RNA یا DNA، و همچنین ژن منفرد تجسم مورد مطالعه میکروسکوپی نمی تواند، بنابراین، به شناسایی جهش های مورد نیاز تشخیص ژنتیکی مولکولی. یک "پروژه ژنوم انسان"، و همچنین پیشرفت های دیگر در ژنتیک مولکولی وجود دارد تا حد زیادی گسترش امکان تشخیص بیماریهای ارثی - هر دو قبل و بعد از تولد. این روش می تواند تشخیص زود هنگام ارائه و ایجاد یک پلی پیش بینی و بیماری های تک ژنی، که اولین گیرد در بزرگسالی است. متاسفانه، به دلیل توانایی های فنی از مطالعات ژنتیکی مولکولی گاهی اوقات فراتر از محدودیت های اخلاقی که در رابطه با ارث تعیین می کنند، به ویژه زمانی که تشخیص در نوجوانی و دوران کودکی است.

ناهنجاری های کروموزومی ساختاری و عددی شایع ترین علل بیماری و سرطان، و بسیاری از ناهنجاری های می باشد. ناهنجاری های کروموزومی باید شناسایی شده، که برای مشاوره خانواده مهم است - برای ارزیابی پیش بینی، همراه با خطر باروری در حاملگی های آینده. تجزیه و تحلیل کروموزوم "استاندارد طلا" از تشخیص ژنتیکی است، اما آن محدود است. فقط روش های تجزیه و تحلیل ژنتیکی مولکولی می تواند بیشتر انجام دهید، زیرا استفاده شبیه سازی مبتنی بر فن آوری برچسب فلورسنت قادر به حساسیت بالا خود را برای شناسایی تغییرات کروموزومی ظریف است که غیر ممکن برای شناسایی کلاسیک وجود دارد مطالعات سیتوژنتیک. این تکنیک به طور فزاینده ای در حال گسترش قابلیت های تشخیصی ما، زمانی که مورد بررسی قرار، کودکان معلول، عقب ماندگی ذهنی، با بسیاری دیگر از بیماری های ارثی.

یافته

این برای بشریت بسیار مهم ساختار ژن و عملکرد دانش، نوع تنوع، توانایی تشخیص بیماری های ارثی که در ارتباط با توسعه ژنتیک مولکولی رخ داده است. روش های آن ها در این مطالعه از مولکول DNA هدف - و عادی زمانی که در آن است، و هنگامی که آن آسیب دیده است. تهیه توالی اسید دئوکسی ریبونوکلئیک از نوکلئوتید (DNA) گسترش در مراحل از دریافت نمونه به شناسایی قطعات منحصر به فرد. جداسازی DNA از سلول ها، محدودیت (پاره شدن)، تقویت (شبیه سازی)، الکتروفورز از قطعات (جدا بار الکتریکی و وزن مولکولی توسط ژل آگارز). شناسایی قطعات خاص واقع بر روی سطح یک نوار گسسته است.

سپس وارد شدن به عمل فیلترهای خاص، که از طریق آن عبور می کند هر هیبریداسیون قطعه با قطعات DNA کلون شده یا پروب رادیواکتیو مصنوعی کنترل، که به هر نمونه آزمون برابر خواهد شد است. اگر شما در موقعیت و یا طول در مقایسه با پروب تغییر دهید، اگر یک قطعه جدید و یا ناپدید - این همه نشان می دهد که ژن مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته است بازسازی در توالی نوکلئوتیدی است. هشت تکنیک های اساسی از مطالعات ژنتیکی مولکولی وجود دارد: تعیین توالی (تعیین توالی DNA)، واکنش زنجیره ای پلیمراز (افزایش در تعداد توالی)، آماده سازی آغازگر شناخته شده ژن ها، شبیه سازی DNA، تولید مولکول نوترکیب مشتق شده از پروتئین به دلیل مولکول نوترکیب، ایجاد یک مجموعه کامل (مجموعه کتابخانه) قطعات که با استفاده از محدودیت به دست آمد کلون.